Viruses. 2012 May;4(5):847-77

San Martín C.

Adenovirus (AdV) capsid organization is considerably complex, not only because of its large size (~950 Å) and triangulation number (pseudo T = 25), but also because it contains four types of minor proteins in specialized locations modulating the quasi-equivalent icosahedral interactions. Up until 2009, only its major components (hexon, penton, and fiber) had separately been described in atomic detail. Their relationships within the virion, and the location of minor coat proteins, were inferred from combining the known crystal structures with increasingly more detailed cryo-electron microscopy (cryoEM) maps.

There was no structural information on assembly intermediates. Later on that year, two reports described the structural differences between the mature and immature adenoviral particle, starting to shed light on the different stages of viral assembly, and giving further insights into the roles of core and minor coat proteins during morphogenesis. Finally, in 2010, two papers describing the atomic resolution structure of the complete virion appeared. These reports represent a veritable tour de force for two structural biology techniques: X-ray crystallography and cryoEM, as this is the largest macromolecular complex solved at high resolution by either of them. In particular, the cryoEM analysis provided an unprecedented clear picture of the complex protein networks shaping the icosahedral shell. Here I review these latest developments in the field of AdV structural studies.

El grupo de Isabel Mérida acaba de identificar la enzima responsable del aumento del diacilglicerol en la sinapsis inmune, un paso esencial para que los linfocitos T puedan coordinar correctamente la respuesta inmunitaria.

Desde su laboratorio del Centro Nacional de Biotecnología del CSIC, Mérida acaba de publicar un trabajo en el que la investigadora postdoctoral Severine Gharbi identifica la enzima responsable del aumento de diacilglicerol en la zona de unión entre un linfocito T y un linfocito B. El aumento de este lípido en la llamada sinapsis inmune es necesario para que los linfocitos T puedan reconocer la proteína de los microorganismos contra los que dirigir su ataque.

Además, marcando la llamada diacilglicerol kinasa ζ de tal modo que se pueda ver verde dentro del linfocito T, han observado cómo se concentra en la zona de unión al linfocito B (en azul). Una vez allí, produce el lípido necesario para que se reorganice la arquitectura de esta zona concreta de los linfocitos de cara a inicar la respuesta inmune.

• Gharbi SI, Rincón E, Ávila-Flores A, Torres-Ayuso P, Almena M, Cobos MA, Albar JP, Mérida I. Diacylglycerol kinase ζ controls diacylglycerol metabolism at the immunological synapse. Mol Biol Cell. 2011 Nov;22(22):4406-14.

Para poder seguir desarrollando la idea de sustituir a los antibióticos por virus que maten a las bacterias, en el Centro Nacional de Biotecnología del CSIC (CNB) estudian las proteínas que permiten a esos virus bacteriófagos anclarse sobre la superficie de las bacterias. Y acaban de publicar en la revista PNAS un avance realmente interesante, desvelando la estructura de una de estas proteínas.

Cada bacteriófago se adhiere de forma muy específica a una especie concreta de bacteria, por lo que, en principio estos virus nunca podrían usarse de forma generalizada. Por ello, y como parte de un proyecto financiado por la Fundación Bill & Melinda Gates, en el grupo de Mark van Raaij trabajan sobre la idea de crear mediante mutaciones puntuales una gran variedad de bacteriófagos que puedan ser utilizados contra el tipo de bacteria que se desee. Su primer paso ha sido estudiar el mecanismo exacto por el que los bacteriófagos se colocan sobre la bacteria y se anclan a su membrana justo antes de empezar la destrucción de la misma.

Analizando con precisión la estructura de las fibras mediante las que el bacteriófago T7 se une a las bacterias, Carmela García Doval y Mark van Raaij han comprobado que están formadas por tres unidades de una misma proteína. Mediante cristalografía de rayos X han determinado la existencia de un área justo antes de la zona que se une a las bacterias que dota a estas fibras de flexibilidad. Una flexibilidad que parece ser importante a la hora de que el virus se ancle correctamente sobre la pared bacteriana.

Gracias a la alta resolución de los datos obtenidos, han podido localizar con precisión las zonas concretas a través de las cuales se produce la unión entre el fago y la bacteria. Estos datos corroboran lo que venían indicando estudios previos de los aminoácidos que forman estas proteínas. Ahora, en su laboratorio del CNB, el grupo de van Raaij pretende generar bacteriófagos que contengan mutaciones aleatorias en las zonas que determinan su unión a las bacterias.

Con los miles de mutantes que planean obtener, tendrán que ir analizando la especificidad con la que se unen a las diferentes bacterias. Una vez que hayan detectado los mutantes que eliminan específicamente a las bacterias patógenas que les interesen, se producirán en grandes cantidades para ensayar su uso como posible tratamiento.

García-Doval C, van Raaij MJ. Structure of the receptor-binding carboxy-terminal domain of bacteriophage T7 tail fibers. Proc Natl Acad Sci USA. 2012 May 28.

Manipulando moléculas individuales de la ADN polimerasa del virus Phi29, el equipo de Borja Ibarra ha conseguido cuantificar por primera vez el mecanismo de apertura del ADN utilizado por esta proteína. Publicado en la revista PNAS, este trabajo ayudará a desarrollar nanomotores sintéticos.

Muchas de las proteínas del interior celular funcionan como auténticos motores moleculares capaces de trabajar eficientemente a escalas nanométricas (mil veces más pequeñas que la de la célula). Para ello, transforman la energía disponible en el interior celular en diminutas fuerzas (picoNewtons: la diez millonésima parte del peso de un miligramo) y desplazamientos (nanómetros: la millonésima parte de un milímetro). Unos de los motores moleculares mas sorprendentes son las ADN polimerasas, las proteínas encargadas de duplicar la doble hélice del ADN que son capaces de leer la composición de bases de cada una de las hebras del ADN e incorporar la base complementaria en cada posición. Sorprendentemente, la polimerasa del virus Phi29 puede avanzar a lo largo del ADN a una velocidad de 6.000 bases por minuto a la vez que abre la doble hélice de la molécula y avanza por ella. Un corredor de obstáculos con estas propiedades sería capaz de correr aproximadamente a 360 km/h e ir saltando vallas separadas por solo 1 metro ¡sin tirar ninguna! Estas sorprendentes propiedades y habilidades de estos nanomotores biológicos, han fascinado durante mucho tiempo a los biólogos moleculares y en los últimos años a una amplia comunidad de físicos e investigadores del área de la nanotecnología.

Clásicamente, el funcionamiento de estos motores se ha estudiado en tubos de ensayo donde millones de polimerasas trabajan al mismo tiempo en una reacción no sincronizada. De esta manera, muchos de los detalles del funcionamiento intrínseco de cada polimerasa se pierden en el promediado final. En colaboración con los grupo de José María Valpuesta y José L. Carrascosa en el Centro Nacional de Biotecnología del CSIC, de  Francisco J. Cao en la Universidad Complutense de Madrid y de Margarita Salas del Centro de Biología Molecular “Severo Ochoa”, Borja Ibarra ha utilizado en su laboratorio del Instituto Madrileño de Estudios Avanzados en Nanocienca (IMDEA Nanociencia) la técnica de las pinzas ópticas para atrapar y manipular moléculas individuales de la polimerasa del virus Phi29. De esta forma estos investigadores han podido seguir la actividad de una sola molécula de polimerasa mientras trabaja y se desplaza abriendo la doble hélice del ADN.

En su estudio han encontrando que este diminuto motor molecular es capaz de acoplar la energía térmica con la energía química derivada de la incorporación de nucleótidos en la ruptura de los puentes de hidrógeno que mantienen unidas las dos cadenas del ADN. De este modo, se llegan a ejercer sobre la doble cadena de ADN fuerzas superiores a los 10 pN (10¹⁰ veces su peso). Escalando la polimerasa al tamaño microscópico, un motor del tamaño del de un coche con la misma relación fuerza-masa sería capaz de ejercer fuerzas efectivas iguales al peso de 300 millones de toneladas métricas, o el peso de unos 700 portaaviones.

Hace tan solo unos años la posibilidad de estudiar los sistemas biológicos a nivel de moléculas individuales parecía una historia sacada de algún libro de ciencia ficción, pero la implementación de avanzadas técnicas de manipulación de moléculas individuales tanto en el IMDEA Nanociencia como en el Centro Nacional de Biotecnología del CSIC está permitiendo que estas historias se hagan realidad. El estudio de los motores moleculares biológicos con estas técnicas esta permitiendo por primera vez en España el establecimiento de una amplia red de colaboración interdisciplinar entre biofísicos, biólogos moleculares y físicos. Además estos nuevos descubrimientos permiten conocer mejor el funcionamiento interno de las células y harán posible diseñar en el futuro nanomáquinas sintéticas que emulen la ingeniosa y eficiente maquinaria molecular diseñada por la naturaleza.

Morin JA, Cao FJ, Lázaro JM, Arias-Gonzalez JR, Valpuesta JM, Carrascosa JL, Salas M, Ibarra B. Active DNA unwinding dynamics during processive DNA replication. Proc Natl Acad Sci USA. 2012 May 9.

Entre probetas - Nanomotores biológicos - 10/07/12

• Entre probetas - Nanomotores biológicos - 10/07/12
  

En colaboración con IMDEA Nanociencia, el investigador del CNB Dr. Fernando Moreno ha organizado el 2º Workshop en Nanobiociencia. Tendrá lugar el próximo viernes 18 de Mayo en la sede del IMDEA Nanociencia, en el campus de la Universidad Autónoma de Madrid.

Esta jornada científica, de un día de duración y con entrada libre, presenta una pequeña muestra de la biociencia de molécula individual que se realiza en España usando técnicas biofísicas como Microscopía de Fuerzas Atómicas (AFM), Pinzas Ópticas y Magnéticas, o Microscopía de Fluorescencia de Alta resolución.

El programa incluye cuatro sesiones con dos conferencias plenarias de investigadores extranjeros expertos en AFM y Pinzas Ópticas y contribuciones cortas de jóvenes biofísicos españoles.

PLoS ONE

Rodríguez-Beltrán J, Rodríguez-Rojas A, Guelfo JR, Couce A, Blázquez J.

DNA is constantly damaged by physical and chemical factors, including reactive oxygen species (ROS), such as superoxide radical (O₂⁻), hydrogen peroxide (H₂O₂) and hydroxyl radical (•OH). Specific mechanisms to protect and repair DNA lesions produced by ROS have been developed in living beings.

In Escherichia coli the SOS system, an inducible response activated to rescue cells from severe DNA damage, is a network that regulates the expression of more than 40 genes in response to this damage, many of them playing important roles in DNA damage tolerance mechanisms. Although the function of most of these genes has been elucidated, the activity of some others, such as dinF, remains unknown. The DinF deduced polypeptide sequence shows a high homology with membrane proteins of the multidrug and toxic compound extrusion (MATE) family. We describe here that expression of dinF protects against bile salts, probably by decreasing the effects of ROS, which is consistent with the observed decrease in H₂O₂-killing and protein carbonylation.

These results, together with its ability to decrease the level of intracellular ROS, suggests that DinF can detoxify, either direct or indirectly, oxidizing molecules that can damage DNA and proteins from both the bacterial metabolism and the environment. Although the exact mechanism of DinF activity remains to be identified, we describe for the first time a role for dinF.

El Dr. Lluís Montoliu, investigador científico del Centro Nacional de Biotecnología del CSIC, y coordinador del nodo español del Proyecto Europeo EMMA (European Mouse Mutant Archive), preside la organización del Cryopreservation Workshop en 2012 que se celebrará en Madrid, en la sede central del CSIC, los días 7 y 8 de mayo de 2012.

Desde EMMA, esta reunión sobre criopreservación se plantea como un foro para discutir al más alto nivel y en profundidad, los últimos avances tecnológicos en la criopreservación de líneas de ratones. Estas técnicas incluyen la criopreservación de esperma y de embriones, métodos actualizados de fecundación in vitro (FIV) y técnicas relacionadas, como criopreservación de ovarios, inyección intracitoplasmática de esperma (ICSI) asistida por laser y piezoinyectores, transporte de material biológico congelado y cualquier otra técnica o reto logístico relevante para el funcionamiento normal de los bancos actuales de embriones y esperma.

Esta será una reunión limitada, con la asistencia prevista de 60 participantes, por invitación, que incluyen los mejores expertos del campo a nivel mundial. Esta reunión está copatrocinada por la International Society for Transgenic Technologies (ISTT) y 10 de sus miembros han sido seleccionados para asistir a partir de las solicitudes recibidas. Los participantes invitados son:

• de los EEUU: Rob Taft, Michael Wiles, Kent Lloyd, Jorge Sztein, Carlisle Landel, Peter Mazur;
• de Canadá: Marina Gertsenstein, Lauryl Nutter;
• de Latino-América: Martina Crispo;
• de Australia: Stuart Read, Sue Bath;
• de China: Xiang Gao;
• de Japón: Naomi Nakagata, Toru Takeo, Keiji Mochida, Atsuo Ogura;
• de Europa: Martin Fray, Pedro Moreira, Alan Hart, Xavier Warot, Jean Jaubert, Marcello Raspa, Sagrario Ortega y Belén Pintado.
  

La revista Structure acaba de publicar el trabajo del grupo de Cristina Risco en el que desarrollan un marcador clonable para la detección de forma individual de una o varias proteínas por microscopía electrónica.

La microscopía electrónica ha contribuido más que ninguna otra metodología a nuestra comprensión de la arquitectura y organización celular. Sin embargo, la detección de proteínas en células a nivel ultraestructural sigue realizándose hoy en día mediante técnicas de inmunomarcaje que no tienen ni la sensibilidad ni la resolución que cabría esperar del uso de los microscopios electrónicos. De ahí que se siga intentando desarrollar nuevas técnicas que permitan identificar de forma directa y de manera cuantitativa las moléculas individuales de las proteínas en el denso entorno intracelular.

El nuevo marcador que ha patentado el CSIC junto con el método utilizado para su visualización denominado Metal-Tagging Transmision Electron Microscopy (METTEM), contiene la secuencia de una pequeña proteína que une metales y le permite formar nanopartículas de 1 nm fácilmente detectables con el microscopio electrónico. La propia Dra. Risco explica que este nuevo método "permite la detección de proteínas en células con gran especificidad, sensibilidad excepcional y resolución molecular".

Como se puede apreciar en la imagen, este marcador (METTEM) tiene una sensibilidad superior en varios órdenes de magnitud a la proporcionada por los anticuerpos en ensayos de inmunomarcaje (Immunogold). Por ello, presenta grandes perspectivas para la visualización y el estudio de las biomoléculas en su entorno celular nativo. La trascendencia en el campo de la microscopía electrónica es potencialmente similar a la alcanzada por las proteínas fluorescentes en microscopía óptica.

Entre probetas - Microscopia electrónica sensible - 26/06/12

• Entre probetas - Microscopia electrónica sensible - 26/06/12
  

Miguel Vicente organiza en el Real Sitio de San Ildefonso el EMBO Workshop Reconstructing the essential bacterial cell cycle machinery. Del 16 al 19 de septiembre de 2012, los participantes tendrán la oportunidad de debatir los avances en la construcción de maquinarias bacterianas en ausencia de células. Los ponentes se centrarán especialmente en los componentes bacterianos implicados en procesos esenciales como la citocinesis, la segregación de los cromosomas y la síntesis de la pared bacteriana.

El Centro Nacional de Biotecnología del CSIC (CNB) acaba de firmar un acuerdo que permitirá almacenar y distribuir embriones y esperma de los ratones modificados genéticamente que se generan en el Centro Nacional de Investigaciones Oncológicas (CNIO). A través del European Mouse Mutant Archive (EMMA), los investigadores del CNIO podrán conservar en el CNB sus líneas de ratones. De este modo están disponibles para la investigación de cualquier científico interesado.

Desde que en enero de 2009 el CNB se convirtiera en el nodo español de EMMA bajo la dirección de Lluís Montoliu, la comunidad científica española ha tenido más fácil el acceso libre a todas aquellas líneas de ratones transgénicos, knockouts o mutantes de interés para la investigación biomédica. A las líneas ya existentes se sumarán ahora aquellas provenientes del trabajo de los investigadores del CNIO, aumentando así la disponibilidad de estudiar la función de multitud de genes con interés en el campo de la oncología.

Al ser un proyecto financiado por la Comisión Europea, la congelación y mantenimiento de ratones en condiciones EMMA es gratuita y el investigador sólo se debe responsabilizarse de los costes de traslado de sus modelos animales al nodo EMMA correspondiente (el CNB en Madrid, en este caso). Esto implica el acceso libre de los modelos animales depositados por la comunidad científica. No obstante, pueden asociarse a cada línea criopreservada en EMMA documentos que protejan la propiedad intelectual de los ratones depositados y puede solicitarse un periodo de hasta 2 años durante los cuales la línea está depositada en EMMA pero no aparece todavía en las bases de datos.

El nodo EMMA incluye la utilización de aisladores de jaulas de ratón, para permitir la recepción segura de ratones cuyo informe sanitario sea distinto al de los ratones alojados en el animalario del CNB. Se pretende con ello universalizar la criopreservación de líneas de ratón y ponerla a disposición de todos los investigadores interesados, con independencia de las características del animalario de origen.