Laboratorio de LLUÍS MONTOLIU
en
el CNB
Temas de investigación 
Lluís Montoliu ha estado interesado en temas relacionados con la
transgénesis desde 1989. Los animales transgénicos constituyen
una de las más poderosas herramientas que existen para comprender
cómo funcionan los genes a lo largo del desarrollo. Además,
se ha demostrado su utilidad para estudiar enfermedades humanas. Sin embargo,
en todo experimento de estas características una proporción
variable de animales transgénicos normalmente no presentan el patrón
de expresión génica esperado. En algunos casos se detecta
expresión ectópica del transgén y, lo que es más
frecuente, su silenciamiento o inactivación. Así pués,
el intentar comprender como se puede mejorar y optimizar la expresión
de un transgén no es solo relevante para la biología básica
sino que es de gran relevancia para aplicaciones en biotecnología
y terapia génica.
La incapacidad de un transgén para desarrollar el programa de expresión
planeado ha sido correlacionada con el sitio
de integración en el genoma del huésped. De esta manera,
un conjunto de eventos complejo y todavía no comprendido en su totalidad
y relacionado con las secuencias vecinas (denominado efectos
de posición) parece ser la causa del comportamiento incorrecto
en el patrón de expresión génica.
Los efectos de posición permiten explicar cómo se organizan
los genes en los cromosomas en forma de unidades independientes, denominadas
dominios
de expresión. Estas unidades frecuentemente contienen elementos
reguladores que pueden estar localizados a grandes distancias del cuerpo
principal del gen (promotor+exones+intrones). No obstante, de esos elementos
reguladores distantes se sabe muy poco y solamente han podido identificarse
en muy pocos casos (p.e. la region controladora del locus, LCR, de los
genes de las beta globinas humanas) y normalmente no se encuentran presentes
en las construcciones transgénicas tradicionales. Los transgenes
habituales se construyen en plásmidos, bacteriófagos o cósmidos
y tienen la capacidad de clonaje de ADN heterólogo limitada a la
propia del vector utilizado (no más de unas pocas decenas de kilobases).
Así, se sugerió que la transferencia de grandes segmentos
de ADN genómico podia representar una mejora en el establecimiento
del adecuado patrón de expresión del transgén.
Los cromosomas artificiales de levadura (del inglés,
YACs) son vectores que pueden ser usados para clonar y manipular eficientemente
secuencias de ADN heterólogo con un tamaño de hasta 1 Mb.
En 1993, el laboratorio del Prof. Schütz, así como otros grupos,
fueron pioneros en la transferencia de YACs a la linea germinal de ratones.
En Heidelberg, nuestro grupo demostró que ratones transgénicos
producidos con un YAC de 250 kb con el gen de la tirosinasa
era capaz de corregir completamente el albinismo
de la cepa utilizada como receptora, siendo la expresión del transgén
dependiente del número de copias e independiente del lugar de inserción.
Esos experimentos iniciales y los siguientes sirvieron para identificar
la Region Controladora de Locus (LCR) en el gen de
la tirosinasa de ratón. El estudio exhaustivo y la caracterización
de este elemento regulador será el principal tema de investigación
del grupo de Lluís Montoliu. El objeto de la investigación
trasciende al propio de la regulación de la expresión del
gen de la tirosinasa y puede, de hecho, ofrecer información valiosa
para la identificación de dominios de expresión y de su posible
aplicación biotecnológica.
Además, a través de una productiva interacción con
el Dr. Glen Jeffery, del UCL, en Londres, ha establecido una colaboración
científica con animales transgénicos para el estudio del
papel de la tirosinasa (afectada por mutación en el albinismo) en
el desarrollo de la retina y del ojo.
CARACTERIZACIÓN FUNCIONAL Y ESTRUCTURAL DE ELEMENTOS
AISLADORES
GENÓMICOS
La reciente secuenciación de genomas de mamíferos (humano
y ratón) ha puesto de manifiesto que el número de genes existentes
(~30.000) es probablemente inferior al anteriormente anticipado. Por contra,
sorprende el porcentaje (~95% del total del genoma) de regiones genómicas
no codificantes (intergénicas), mayoritariamente dominadas por diferentes
tipos de elementos repetitivos. Adicionalmente, en estas regiones intergénicas
residen distintos tipos de elementos reguladores que cooperan de forma
crucial en el establecimiento e identificación de los dominios de
expresión, definidos como el conjunto de secuencias colindantes
a un locus que poseen la capacidad de restringir y garantizar la expresión
de un gen determinado en un tiempo y en un lugar precisos. Entre los elementos
reguladores destacan los aisladores genómicos
(boundaries) cuya función sería impedir que los
sistemas de regulación de la expresión génica propios
de cada dominio interfirieran con los correspondientes reguladores de los
dominios adyacentes. El conocimiento estructural y funcional de estas regiones
aisladoras genómicas no solamente tiene interés biológico
básico sino que es fundamental en cualquier proceso de transferencia
génica biomédico o biotecnológico (modelos animales,
terapia génica, producción de proteínas recombinantes),
en los que se persigue la óptima expresión de genes heterólogos
en sitios ectópicos del genoma o extracromosomales. En el laboratorio
se dispone de dos modelos experimentales especialmente indicados para estudiar
la transferencia génica: basados en el gen de la tirosinasa y la
corrección del albinismo en ratones transgénicos y el gen
de la proteína ácida del suero de la leche, WAP, específico
de glándula mamaria. Estudios anteriores han demostrado la existencia
de una aislador genómico en la región controladora de locus
(LCR) del gen de la tirosinasa. Estudios recientes sugieren la presencia
de elementos análogos en el gen WAP. En este proyecto se profundizarán
los estudios estructurales y funcionales del aislador del gen de la tirosinasa
(y de otros posibles aisladores que puedan estar asociados a otras zonas
de este gen y de otros genes, como el gen WAP). Adicionalmente se evaluará
sistemáticamente su potencial utilidad en diferentes sistemas heterólogos:
cultivos celulares de mamíferos, vectores retrovirales, animales
(ratones y Drosophila) transgénicos, cromosomas artificiales de
mamífero, con el objeto de valorar si la presencia de estos aisladores
redunda en una mayor eficiencia del proceso de transferencia génica.
Resumen de investigación del
Laboratorio del Dr. Lluís Montoliu 2003-2004 (PDF
format)
Last Update: 28 September 2005
