Protocolo de PCR para DNA genómico

									Lluís Montoliu, CNB (Lab.111)

PCR-mix (x1)

Reactivos				Volumen final= 25 l		Concentracion final

PCR-buffer(1) 10x			2.5 l				1x (2 mM MgCl2)
dNTPs 10x (2 mM de cada uno)		2.5 l				0.2 mM (=200 M de cada uno)
Oligo 1 100 M(2)			0.125 l			0.5 M (=0.5 pmol/l)
Oligo 2 100 M(2)			0.125 l			0.5 M (=0.5 pmol/l)
Taq-polimerasa(3) (3-5 U/l)		0.25 l				0.75-1.25 U/reacción
H2O mQ estéril(4) , hasta 24 l		18.5 l	

Total=					24 l

Añadir 					+1 l DNA(5)

Volumen final(6) =			25 l

CONTROLES(7) : 		Negativo	1 l H2O mQ estéril(4)
				Positivo	1 l de Plásmido en H2O mQ estéril(4) a 2-5 pg/l

NOTAS:

(1).- PCR-buffer x10 es (100 mM Tris-HCl pH=8.3 (a 20 oC), 500 mM KCl, 20 mM MgCl2). La concentración final de Mg2+ en la reacción de PCR es de 2 mM. Este buffer es similar al suministrado por Boehringer-Mannheim (que incluye solamente 1.5 mM de Mg2+ final), por lo que si se utiliza el de Boehringer-Mannheim hay que completar con Mg2+ hasta 2 mM final (añadir 0.5 l de 25 mM MgCl2 para un volumen final de 25 l). El rango de concentración utilizable de Mg2+  final oscila entre 1-4 mM.

(2).- 1 M = 1 pmol/l. En un oligonucleótido “tipo” de 20 bases (5 A + 5 T + 5 G + 5 C) aproximadamente 1 M = 7 ng/l, luego si se trabaja en ng/l o se convierte a mM o se debe garantizar aproximadamente una concentración final de 3.5 ng/l de cada oligonucleótido. El rango de concentración utilizable de oligonucleótidos oscila entre 0.1-2 M final (=0.7-14 ng/l). Para calcular el peso molecular aproximado de un oligonucleótido se puede multiplicar el número de bases x 330 (que es el peso molecular medio de una base). Para calcular la concentración de un oligonucleótido en solución acuosa mediante espectrofotometría se pueden utilizar los siguientes coeficientes de extinción molar (EM); (A, EM=16000; T, EM=9600; G, EM=12000; C, EM=7000) y aplicar la formula:
			(O.D.260nm x Factor de dilución x 1x10+6)
	________________________________________________________ = M (=pmol/l)
	(Nº de As x EMA + Nº de Ts x EMT + Nº de Gsx EMG + Nº de Csx EMC)

(3).- Taqs recomendables son las de Perkin-Elmer, Amersham, Boehringer-Mannheim, BioTools,... por este orden de preferencia. Es posible que otras Taqs requieran el uso de tampones específicos. En cualquier caso garantizar la concentración final de Mg2+  de 2 mM.

(4).- Agua mQ estéril que solamente se utiliza para experimentos de PCR, renovar frecuentemente, mantener en recipientes de pequeño volumen, sirve para los controles negativos.

(5).- Obtener DNA genómico a partir de biopsias de cola de ratón según protocolo establecido, resuspendiendo el DNA al final en 150 l de TE. Con ese protocolo se obtiene habitualmente una concentración de DNA genómico entre 0.5-2 g/l. 

(6).- Si el DNA está muy concentrado o la muestra de DNA muy sucia puede prepararse una PCR-mix con un volumen final de 50 l (o diluir previamente el DNA 1/10).

(7).- Incluir SIEMPRE un control positivo y un control negativo. Pipetear el control negativo en primer lugar, antes que las muestras. Seguidamente pipetear las muestras y finalmente, y exclusivamente bajo campana de flujo laminar, pipetear el control positivo con todos los demas tubos cerrados y sin muestras a la vista.

Programa de amplificación recomendado 

(Para tubos de PCR de 0.2 ml en Termociclador con tapa calefactora y sin aceite)

NOTA: para oligonucleótidos con Tm ≥ 65 oC, de 25 a 30 nucleótidos, y banda de PCR ≤ 2 kb

				2’	94 oC

			35x	30’’	94 oC
				30’’	65 oC
				2’	72 oC

				10’	72 oC
				∞	4 oC

Análisis de las muestras

Gel de electroforesis de agarosa al 1-2% (segun tamaño del fragmento de PCR)
Añadir 5 l de SBx6 (Sample Buffer x6) a los 25 l de volumen final y cargar en el gel 10-20 l.

Preparación de PCR-mix

Calcular siempre un poco más de la necesaria para compensar los errores inevitables de pipeteo.

Valores de la tabla expresados en l (redondeados)

PCR-mix		5x	10x	15x	20x	25x	30x	35x	40x	50x	60x

PCRx10		12.5	25	37.5	50	62.5	75	87.5	100	125	150
dNTPs 2 mM		12.5	25	37.5	50	62.5	75	87.5	100	125	150
Oligo 1 100 M	0.6	1.3	1.9	2.5	3.1	3.8	4.4	5	6.3	7.5
Oligo 2 100 M	0.6	1.3	1.9	2.5	3.1	3.8	4.4	5	6.3	7.5
Taq 3-5 U/l		1.3	2.5	3.8	5	6.3	7.5	8.8	10	12.5	15
H2O (hasta 24 l)	92.5	185	277	370	463	555	647	740	925	1110