INTRODUCCIÓN
Citometría de flujo es una tecnología en la cual se miden
simultáneamente múltiples parámetros de una célula o partícula
(previamente marcadas con fluorocromos) en suspensión dentro de una
población heterogénea. Para ello hacemos pasar dichas células, a
velocidad constante
de varios miles por segundo y dentro de un flujo laminar, a través de
un cámara de flujo sobre la que incide un haz de luz
coherente a una longitud de onda específica “Láser”.
Como consecuencia del impacto, se produce una dispersión de luz
policromática generada por los diferentes fluorocromos que es captada
por diversos detectores de gran sensibilidad. Los datos generados se
analizan estadísticamente mediante varios softwares específicos que nos
dan una gran información acerca de sus características intrínsecas y /
o extrínsecas así como estructurales y / o funcionales de las células.
La citometría de flujo se utiliza en muy diversas aplicaciones, que van
desde inmunofenotipado, muerte celular, análisis de ploidías, contaje
celular, expresión de genes reporteros, etc
La importancia del análisis por citometría de flujo, es que las medidas
se hacen individualmente sobre cada partícula de la suspensión, y no
como valor medio de la población total.
Las ventajas que proporciona la citometría de flujo frente a otros
métodos que emplean fluorocromos son la objetividad, elevada
sensibilidad y velocidad de análisis, posibilidad de realizar
mediciones simultáneas y separación celular en los Sorter. Las
desventajas son los costes de instrumentación y la incapacidad de
visualizar las células que estamos analizando.
Cell Sorting
La separación celular por citometría de flujo o “Cell
Sorting” es el proceso de separación física de partículas en base a la
expresión diferencial de uno o varios parámetros analizables por
técnicas de citometría de flujo analítica. Las separaciones de
células o poblaciones celulares homogéneas se realizan con objeto de
llevar a cabo posteriormente ensayos bioquímicos, moleculares o de
diferenciación celular de poblaciones de interés, y requieren de la
utilización de sofisticados aparatos de citometría de flujo,
denominados “Cell Sorters”. Existen varios modos de “sorting”
que se ajustan en función de cuales sean los requisitos de cada
separación. Los distintos ajustes permiten, por ejemplo, optimizar la
pureza de la población separada, optimizar la recuperación celular de
la población separada o separar números exactos de células en placas
multipocillo.
Tienen menor potencia que las técnicas de separación masiva
(centrifugación, etc...), pero permiten separaciones que estas técnicas
no consiguen. . Actualmente se puede hacer separación
inmunomagnética para las cuales hay diferentes casas comerciales que
tienen gran variedad de reactivos y aparatos.
Los Sorters se caracterizan por:
5.1.- Recuperación (recovery): porcentaje de partículas sorteadas
recogidas en el colector, del total de partículas activadas por el
Sorter.
5.2.- Pureza (purity): porcentaje de partículas sorteadas recogidas que
cumplen los criterios seleccionados, en función del total sorteado.
5.3.- Rendimiento: porcentaje de partículas recogidas que cumplen los
criterios seleccionados, en función de las partículas teóricas que los
cumplirían.