RESUMEN DE INVESTIGACIÓN

Nuestro grupo lleva a cabo tanto investigación básica como aplicada  con objetivo comprender y explotar biotecnológicamente la secreción de proteínas en cepas de E. coli tanto patógenas como comensales y de laboratorio. Nuestra investigación básica se centra en los mecanismos moleculares para secreción de diversas proteínas (por ejemplo, citotoxinas, proteasas, adhesinas) y para el ensamblaje de organelas en la superficie celular (por ejemplo, las fimbrias) que participan en la virulencia de estas bacterias. Nos centramos especialmente en las proteínas y organelas secretadas por las cepas enteropatógenas (EPEC), enterohemorrágicas (EHEC) y uropatógenas (UPEC) de E. coli. Los proyectos biotecnológicos buscan la explotación de estos sistemas para el desarrollo de tecnologías de expresión y selección de anticuerpos recombinantes en cepas de E. coli comensales y de laboratorio. Entre los formatos de anticuerpos recombinantes disponibles (por ejemplo, Fabs, fragmentos monocadena Fv, fusiones Fc, etc), nos centramos en los anticuerpos monodominio (sdAbs) o nanobodies, que son los fragmentos de anticuerpo más pequeños conocidos (~15 kDa) con capacidad total de unión al antígeno. Los nanobodies se basan en un único dominio V_H obtenido por tecnología  recombinante a partir de anticuerpos con sólo cadenas pesadas presentes en camélidos (por ejemplo, dromedarios, llamas). A pesar de la falta de un dominio V_L, los nanobodies muestran alta afinidad y especificidad por los antígenos. Además son muy similares a los secuencias humanas V_H3, lo que los hace excelentes candidatos para múltiples aplicaciones, incluyendo la terapia en humanos.

Algunos de nuestros proyectos actuales son:

1) El mecanismo molecular de los sistemas secreción tipo V (T5SS) y su aplicación en la presentación de anticuerpos monodominio en la superficie de E. coli (bacterial display).

Los T5SS incluyen proteínas con capacidad de "auto-transportarse" a través de la membrana externa, como la familia de intiminas e invasinas y los autotransportadores clásicos (ATs), que son la familia de proteínas secretadas más abundante en las bacterias Gram-negativas. Los ATs tienen distintas funciones biológicas durante la patogenia del microorganismo productor (por ejemplo, la proteólisis de anticuerpos y otras proteínas del huésped, inducir citotoxicidad a las células del huésped, la adhesión a los tejidos, etc.) Además de investigar el mecanismo de secreción de los ATs, estamos explotando los dominios de transporte de los T5SSs para presentar nanobodies en la superficie de E. coli para la selección de anticuerpos contra antígenos específicos desde genotecas de anticuerpos (bacterial display).

2) El ensamblaje de las fimbrias tipo 1 en E. coli.

Las fimbrias tipo 1 son delgados filamentos proteicos presentes en la superficie de las células de E. coli formados por la polimerización ordenada de una subunidad mayoritaria (FimA) y varias subunidades minoritarias (FimF, FimG, FimH) mediante la ruta de secreción chaperone-usher. Las fimbrias tipo 1 y la adhesina FimH son esenciales para la colonización efectiva y la invasión de las células epiteliales de la vejiga urinaria por cepas UPEC. Hemos encontrado que el dominio lectina N-terminal de FimH es reconocido por el usher fimbrial FimD para iniciar el ensamblaje de la adhesina y la polimerización de los filamentos de las fimbrias. El mecanismo de activación de FimD por el dominio lectina N-terminal de FimH está siendo investigado.

3) Inyección de nanobodies a células humanas con E. coli.

Estamos empleando el sistema de secreción de proteínas tipo III (T3SS) de cepas de E. coli EPEC y EHEC cepas de E. coli, para inyectar directamente los anticuerpos de monodominio desde E. coli al citoplasma de las células humanas. Durante la infección, los T3SS actuan como jeringas moleculares para la translocación de las proteínas desde la bacteria a la célula eucariota. La inyección de nanobodies por E. coli no requiere la invasión bacteriana de la célula eucariota o la transferencia de material genético.